Строители генетических цепей сталкиваются с теми же затруднении, так как строители цифровых схем: испытания их конструкций. Но в отличие от биоинженеры, инженеры простой и универсальный инструмент тестирования мультиметр — что они могут прикоснуться к их цепи, чтобы измерить его производительность. “Нет ничего отдаленно похожего на это в био”, — говорит Питер Карр, синтетический биолог в биотехнических систем и технологий лаборатории Линкольна Массачусетского технологического института.
Это было до недавнего времени. Карр и исследователей в его группа разработали систему, которую они сравнивают с “biomultimeter”. Система, названная Персии, использует флуоресцентного мечения для освещения различных частей генетического цепи и позволяет исследователям для измерения биологических функций, включая транскрипции, трансляции и другие активности ферментов в лабораторных условиях в режиме реального времени. Документ с описанием эта работа была опубликована онлайн в журнале ACS синтетической биологии.
“Теперь у нас есть способ быстро проверить новые проекты генетического кода в определенных генах. Мы можем ускорить, как мы задавать и отвечать на вопросы с ДНК”, — говорит соавтор Дэвид Уолш.
Флуоресцентные метки
Для синтетических биологов инженер клеток, которые работают как они хотят — мол, иммунитет к вирусу — они должны быть в состоянии сказать, какие именно гены клетка выразить. Для этого они используют синтетическую ДНК в программу генетических цепей, которые контролируют поведение клеток. Путем измерения транскрипции (процесс, при котором ДНК ген копируется в РНК) и трансляция (процесс, при котором что РНК считывается для того чтобы произвести протеины) биоинженеры можете узнать, насколько хорошо схема работает.
Белки, такие как зеленый флуоресцентный белок (GFP) уже любимый инструмент тестирования для экспрессии генов. С такими методами, ген, который несет инструкции для получения флуоресцентных пигментов можно сплавить к генов в последовательности ДНК, которые производят белок. Кгв свечение позволяет биологам известно, что этот белок вырабатывается.
Пока кгв уже меняют правила игры для биомедицинских, она имеет свои ограничения. Например, флуоресцентные белки большие, насчитывающие более 200 аминокислот, которые съедают ограниченные ресурсы в ин-витро тест и может нарушать естественную функцию белка. Они также потребуется время, чтобы излучать свой сигнал; таким образом, GFP является репортер из прошлого, а когда дела не идут как запланировано, непонятно, что пошло не так и когда.
Персии, с другой стороны, использует малые флуоресцентный теги добавлены для исследователя белка. Потому что теги Персии настолько малы, они могут быть присоединены к протеинам в генетической цепи, что позволяет для изучения различных частей его. Они также выбрасывают быстрее, чем КГП на несколько минут, больше представитель Ставки транскрипции и трансляции.
“Мы меняем кгв с чем-то меньше, что легче передвигаться и перенастроить, и измерения флуоресцентных сигналов, поскольку эти процессы происходят”, — говорит Карр.
Персия расшифровывается PURExpress-ReAsH-шпинат в Инвитро анализ и использует готовые продукты, перечисленные в его названии. PURExpress является бесклеточной “суп”, в котором размещается экспериментов; этот тип в лабораторной среде, что позволяет для изучения конкретных биологических процессов, помимо полного живого организма.
Шпинат-это имя тега РНК, что сливается с ген. Он будет светиться зеленым, когда ДНК гена транскрибируется в РНК и как он реагирует на химический реагент в Персии смеси. Второй, тэг пептид также прилагается к гену. Этот тег будет светиться красным, как это переводится в конце белка и при взаимодействии с другим химическим реагентом в Персии смесь называется ReAsH.
Во время эксперимента, все эти ингредиенты — тег-кодирующих последовательностей ДНК и реагенты — смешиваются вместе. Наблюдение флюоресценции. Количество и активность РНК и белков, продуктов транскрипции и трансляции, по существу немедленно известно.
Генетические и клинические конструкций
Из-за его быстрой флуоресценции, Персии может ускорить оценку генетический код с рисунки и выступать в качестве инструмента скрининга для очевидных ошибок. “Можно прогнозировать, что произойдет”, — говорит Скотт фитиль, первый автор бумаги. “Недели, если не месяцы времени сохраняются ниже по течению для прототипирования, тестирования различных конструкций и многие другие испытания, прежде чем попасть к изучению этих инженерных кодов в естественных условиях.”
Разработчики протестировали Персии, используя его на экране собственного переделывается генетический код кишечной палочки. Изменения в ReAsH флуоресцентного сигнала показал, что один из них переделывается причиной перевода в отвес. Затем они изучили, какие генетические изменения конкретно может отвечать за этот дефект и построил синтетическую ДНК, чтобы оценить их лучшие догадки. С помощью всего нескольких ДНК-последовательность модификаций и тесты с Персией, их пересмотренный дизайн Гена был столь же продуктивной, как исходный ген кишечной палочки.
“Персия давайте быстро решать, как производство белка ушла далеко и показал, как мы могли бы вернуть его к нормальным уровням”, — говорит Карр.
За ее использование для представления о транскрипции и перевод, Персии является также ценным для изучения того, как белок работает. Например, команда продлила Персию, чтобы следить за активностью фермента ВИЧ-1 протеазы, которая созревает белков вируса ВИЧ и является одной из главных мишеней для анти-ВИЧ препаратов. Они реконструировали клинических вариантов ВИЧ-1 гена протеазы, как известно, демонстрируют устойчивость к этим препаратам. Затем они добавили продукт в Персию, что флуоресцирует с ВИЧ-1 активность протеаз, с использованием результатов мониторинга влияния различных анти-ВИЧ препаратов на каждый вариант. Образцы вариантов сопротивления определяется из Персии тесты были в соответствии с их известными шаблонами сопротивления описаны в Стэнфордском базе устойчивость к ВИЧ-препаратам.
“Когда вы думаете о все генетическое разнообразие, что вирусная инфекция, это созвездие из вариантов, вы хотите быстрый способ тестирования, что разнообразие для выбора лучшей лекарственной терапии”, — говорит Карр. “Мы можем сделать эти испытания сопротивления с Персией, многие из них, и быстрее, чем это было возможно ранее, и надеются использовать его для придания пациентов персонализированных лекарств. Таким образом, пациент не эксперимент”.
Аналогично, средство Персии не может быть применена к безопасности здоровья, благодаря чему исследователи реагировать на новые и потенциально смертельных болезней путем быстрого скрининга эффективности существующих лекарственных средств.
Масштаб микрофлюидных
Исследовательская группа осуществляет Персии в масштабе МКЛ, в стандартных пластин мультивилла. Но они также продемонстрировали потенциал для миниатюризации подход в микрожидкостных устройств, в масштабе nanoliters. Они разработали устройство микрофлюидных с реакторами 96 и ряда клапанов, которые автоматически контролировать поток жидкости через устройство. В качестве реагентов, используемых в Персии может быть дорогостоящим, микрофлюидика выполняют сотни тестов, одновременно используя при этом только у ничтожного количества этих веществ. Дом микрофлюидных устройств включить еще большего числа параллельных реакторов-одна из следующих целей команды.
Еще надеюсь, что и другие ученые найдут Персии так полезны, как это было для работы лаборатории. Система пришла вместе более пяти лет, в течение которых команда заметила, что они могли использовать этот простой метод для ответа на многочисленные вопросы о ДНК-конструкций.
“Персия задает основу для ускорения процесса к научному открытию,” фитиль говорит. “Вот что мне больше всего нравится”.
